О Patch-Clamp I

Поскольку я начал хвастаться своими достижениями в patch-clamp, придется наконец выполнить давние обещания и рассказать, что это такое.


Живые клетки покрыты мембраной, структурную основу которой составляет двойной слой липидов, слабо проницаемый для воды и практически непроницаемый для ионов небольшого радиуса. Однако, клетка должна обмениваться этими веществами с внешней средой. Кроме того, трансмембранные ионные потоки важны для процессов возбуждения клетки и передачи сигналов. Эти потоки осуществляются через встроенные в мембрану белки — каналы и транспортеры.

Транспортеры — это белки, которые образуют с переносимым веществом комплекс по одну сторону мембраны, после чего меняют конформацию, так что транспортируемое вещество оказывается по другую сторону мембраны, и там его освобождают. По пути заметим, что самый важный транспортер в клетках эукариот – это натрий-калиевый насос, который активно, используя энергию АТФ, переносит за каждый цикл своей работы 3 иона Na⁺ из клетки и 2 иона K⁺ в клетку. Одна молекула этого транспортера выполняет примерно 10³ циклов в секунду.

Каналы — это белки, которые формируют поры в мембране. Однако радиус и распределение заряженных функциональных групп в этих порах таково, что они селективны — проницаемы только для определенных ионов. В частности, имеются натриевые и калиевые, а так же хлоридные каналы. В действительности, для каждого из этих ионов имеется довольно много различных каналов. Через одиночный канал за секунду проходит в типичном случае 10⁶ — 10⁷ ионов.

Далее, если имеется канал и через него идет поток ионов, то вместе с ними переносится и заряд — то есть течет электрический ток, который можно измерить. (Проводимость одиночного канала в открытом состоянии колеблется, в зависимости от типа канала, от 1–2 до 30–50 пикосименсов, так что при разности потенциалов в 100 мВ имеем ток в несколько пикоампер.

Так вот, patch-clamp — это метод, позволяющий измерять токи мембранных ионных каналов.

В 1981 г. E.Neher и B.Sakmann обнаружили, что если стеклянной пипеткой с диаметром 1–2 микрона коснуться клеточной мембраны, то между ними образуется контакт с сопротивлением в несколько гигаОм, при чем контакт этот оказывается механически довольно прочным. В дальнейшем такой контакт мы будем называть gigaseal. Если такую пипетку заполнить раствором электролита и поместить в нее хлор-серебряный электрод, другой электрод поместить в омывающий клетку раствор, а между ними поставить оборудование, которое будет задавать определенную разность потенциалов между электродами и измерять ток, который для этого необходим, то мы и получим patch-clamp установку.

На фото 1 показана часть такой установки, правда, не моей, а коллеги, работающего на ооцитах Xenopus Laevis.



Огромная сфера, часть которой видна на мониторе в центре фотографии – это как раз ооцит, находящийся в данный момент на предметном столике микроскопа, к нему подведена patch-пипетка, ее диаметр у носика – около 3 микрон. После установления gigaseal она изолирует кусочек мембраны площадью 3.14*1.5² мкм², и если в этом кусочке окажутся ионные каналы, их ток можно будет записывать. Такая конфигурация называется cell-attached patch-clamp. Она иллюстрируется следующей схемой:



Эта конфигурация, однако, имеет два неудобства.
Во-первых, она не позволяет с достаточной надежностью измерять (а тем более — задавать!) трансмембранную разность потенциалов — поскольку оба электрода — как пипеточный, так и внешний, находятся по одну сторону мембраны. Правда, можно, использовав омывающий раствор с ионной композицией, повторяющей состав цитоплазмы, деполяризовать мембрану вне пипетки, так что разность потенциалов между внешним электродом и цитоплазмой исчезнет, а тогда разность потенциалов между электродами окажется равна трансмембранному потенциалу — но это весьма приблизительно, так как точный состав цитоплазмы нам вообще-то неизвестен.
Во-вторых,эта конфигурация не позволяет менять состав среды вне пипетки (как цитоплазма была, так и есть).
В силу этих причин cell-attached mode применяется довольно ограниченно.
Однако, если пипетку быстрым движением отвести от клетки, то, если повезет, "внутренний" кусочек мембраны оторвется от клетки и получится конфигурация inside-out (потому, что внутренняя, обычно обращенная к цитоплазме, сторона мембраны, окажется снаружи – в омывающем растворе, а наружная – внутри пипетки. (Картинка на схеме 2.)



Теперь разность потенциалов на фрагменте мембраны строго равна разности потенциалов между электродами. Очевидно, что при использовании такой модификации пипетку заполняют раствором, имитирующим внеклеточную среду, тогда как омывающий раствор делают близким по составу к цитоплазме. При этом, меняя состав омывающего раствора, можно изучать, как такие изменения в цитоплазме (ведь омывающий раствор контактирует с цитоплазматической стороной мембраны) будут действовать на поведение канала. При этом мы точно знаем как состав жидкости по обе стороны мембраны, так и разности потенциалов, что позволяет достаточно точно характеризовать каналы, используя уравнения Нернста и Гольдмана-Ходжкина-Каца, так что на этом уровне электрофизиология превращается в физику каналов. при этом, если в изолированный участок мембраны попал один канал, то мы наблюдаем поведение единичной молекулы и, если это лиганд-регулируемый канал, то ее взаимодействие с другими единичными молекулами.

Ну а если мы хотим менять состав внеклеточной среды? Тогда можно не отводить пипетку от клетки,а подать в нее отрицательное давление и разрушить изолированный кусочек мембраны, перейдя таким образом в whole-cell mode:



Теперь пипетка соединена с внутриклеточной средой; поскольку клетка обычно маленькая, то, благодаря диффузии, состав цитоплазмы вскоре оказывается идентичным составу пипеточного раствора, поэтому мы, как и в предыдущем случае, знаем как состав жидкостей, так и разность потенциалов. Кстати, если в конфигурации inside-out пипеточный электрод был внеклеточным, а внутренний — внутриклеточным, то теперь их роли изменились, так что задавая потенциал, необходимо инвертировать полярность.
Преимущество этого метода состоит и в том, что здесь оказываются сохранны все клеточные структуры и регуляторные механизмы. Но есть и недостаток — мы измеряем суммарный ток всех каналов в клетке, а ведь мы только что радовались мощи метода, позволяющего наблюдать поведение единичной молекулы. Как же быть?
Оказывается, если после перехода в whole-cell mode медленно отводить пипетку от клетки, мембрана не отрывается сразу, а начинает вытягиваться в трубку — это видно на следующей фотографии:



Кстати, обратите внимание — в пипетке отчетливо видны кусочки цитоплазмы, попавшие туда после разрушения мембраны при переходе в whole-cell.

Следующая фаза процесса:



Мембранная трубка стала совсем тонкой и почти невидима ("протуберанец" у поверхности клетки — это небольшая часть цитоплазмы, оставшаяся в мембранной трубке).
В следующее мгновение трубка порвется, а мембрана сомкнется на пипетке в "вывернутом" виде — мы окажемся в конфигурации "outside-out":



В этом случае пипетка и ее электрод — подобно конфигурации whole-cell — внутриклеточные, мы свободно играем внеклеточным раствором, площадь исследуемой мембраны невелика, так что мы вновь можем изучать одиночные каналы.

Итак, patch-clamp — это метод, позволяющий изолировать фрагмент клеточной мембраны с имеющимися в нем ионными каналами, задавать определенную разность потенциалов через этот фрагмент, создавать по обе стороны мембраны среду с определенным составом и измерять, при этих хорошо контролируемых условиях, ток ионных каналов. Гигантская аналитическая мощь этого метода состоит в том, что он позволяет наблюдать поведение и химические превращения единичных молекул. Разные модификации метода позволяют в эксперименте менять различные — а в сумме все, представляющие интерес, переменные, способные влиять на поведение каналов.

В заключение — ссылки на другие посты, имеющие отношение к теме.

Фотография ооцитов Xenopus laevis в чашке Петри на столике для инъекций РНК

На последней фотографии — предметный столик моей patch-clamp установки . Видны две patch-пипетки (из них одна — на дне камеры, может быть даже на клетке; в плексигласовом зажиме с винтом — внешний электрод.

Об ионных каналах, транспортерах и их свойствах — в следующих выпусках. Если кому-нибудь интересно (о чем можно сообщить в комментах :) )

реимпорт