?

Log in

No account? Create an account
 

О Patch-Clamp I - Отклики

About О Patch-Clamp I

Previous Entry О Patch-Clamp I 18 янв, 2006 @ 03:48 Next Entry
Поскольку я начал хвастаться своими достижениями в patch-clamp, придется наконец выполнить давние обещания и рассказать, что это такое.


Живые клетки покрыты мембраной, структурную основу которой составляет двойной слой липидов, слабо проницаемый для воды и практически непроницаемый для ионов небольшого радиуса. Однако, клетка должна обмениваться этими веществами с внешней средой. Кроме того, трансмембранные ионные потоки важны для процессов возбуждения клетки и передачи сигналов. Эти потоки осуществляются через встроенные в мембрану белки — каналы и транспортеры.

Транспортеры — это белки, которые образуют с переносимым веществом комплекс по одну сторону мембраны, после чего меняют конформацию, так что транспортируемое вещество оказывается по другую сторону мембраны, и там его освобождают. По пути заметим, что самый важный транспортер в клетках эукариот – это натрий-калиевый насос, который активно, используя энергию АТФ, переносит за каждый цикл своей работы 3 иона Na+ из клетки и 2 иона K+ в клетку. Одна молекула этого транспортера выполняет примерно 103 циклов в секунду.

Каналы — это белки, которые формируют поры в мембране. Однако радиус и распределение заряженных функциональных групп в этих порах таково, что они селективны — проницаемы только для определенных ионов. В частности, имеются натриевые и калиевые, а так же хлоридные каналы. В действительности, для каждого из этих ионов имеется довольно много различных каналов. Через одиночный канал за секунду проходит в типичном случае 106 — 107 ионов.

Далее, если имеется канал и через него идет поток ионов, то вместе с ними переносится и заряд — то есть течет электрический ток, который можно измерить. (Проводимость одиночного канала в открытом состоянии колеблется, в зависимости от типа канала, от 1–2 до 30–50 пикосименсов, так что при разности потенциалов в 100 мВ имеем ток в несколько пикоампер.

Так вот, patch-clamp — это метод, позволяющий измерять токи мембранных ионных каналов.

В 1981 г. E.Neher и B.Sakmann обнаружили, что если стеклянной пипеткой с диаметром 1–2 микрона коснуться клеточной мембраны, то между ними образуется контакт с сопротивлением в несколько гигаОм, при чем контакт этот оказывается механически довольно прочным. В дальнейшем такой контакт мы будем называть gigaseal. Если такую пипетку заполнить раствором электролита и поместить в нее хлор-серебряный электрод, другой электрод поместить в омывающий клетку раствор, а между ними поставить оборудование, которое будет задавать определенную разность потенциалов между электродами и измерять ток, который для этого необходим, то мы и получим patch-clamp установку.

На фото 1 показана часть такой установки, правда, не моей, а коллеги, работающего на ооцитах Xenopus Laevis.

36,74 КБ

Огромная сфера, часть которой видна на мониторе в центре фотографии – это как раз ооцит, находящийся в данный момент на предметном столике микроскопа, к нему подведена patch-пипетка, ее диаметр у носика – около 3 микрон. После установления gigaseal она изолирует кусочек мембраны площадью 3.14*1.52 мкм2, и если в этом кусочке окажутся ионные каналы, их ток можно будет записывать. Такая конфигурация называется cell-attached patch-clamp. Она иллюстрируется следующей схемой:

2,41 КБ

Эта конфигурация, однако, имеет два неудобства.
Во-первых, она не позволяет с достаточной надежностью измерять (а тем более — задавать!) трансмембранную разность потенциалов — поскольку оба электрода — как пипеточный, так и внешний, находятся по одну сторону мембраны. Правда, можно, использовав омывающий раствор с ионной композицией, повторяющей состав цитоплазмы, деполяризовать мембрану вне пипетки, так что разность потенциалов между внешним электродом и цитоплазмой исчезнет, а тогда разность потенциалов между электродами окажется равна трансмембранному потенциалу — но это весьма приблизительно, так как точный состав цитоплазмы нам вообще-то неизвестен.
Во-вторых,эта конфигурация не позволяет менять состав среды вне пипетки (как цитоплазма была, так и есть).
В силу этих причин cell-attached mode применяется довольно ограниченно.
Однако, если пипетку быстрым движением отвести от клетки, то, если повезет, "внутренний" кусочек мембраны оторвется от клетки и получится конфигурация inside-out (потому, что внутренняя, обычно обращенная к цитоплазме, сторона мембраны, окажется снаружи – в омывающем растворе, а наружная – внутри пипетки. (Картинка на схеме 2.)

2,41 КБ

Теперь разность потенциалов на фрагменте мембраны строго равна разности потенциалов между электродами. Очевидно, что при использовании такой модификации пипетку заполняют раствором, имитирующим внеклеточную среду, тогда как омывающий раствор делают близким по составу к цитоплазме. При этом, меняя состав омывающего раствора, можно изучать, как такие изменения в цитоплазме (ведь омывающий раствор контактирует с цитоплазматической стороной мембраны) будут действовать на поведение канала. При этом мы точно знаем как состав жидкости по обе стороны мембраны, так и разности потенциалов, что позволяет достаточно точно характеризовать каналы, используя уравнения Нернста и Гольдмана-Ходжкина-Каца, так что на этом уровне электрофизиология превращается в физику каналов. при этом, если в изолированный участок мембраны попал один канал, то мы наблюдаем поведение единичной молекулы и, если это лиганд-регулируемый канал, то ее взаимодействие с другими единичными молекулами.

Ну а если мы хотим менять состав внеклеточной среды? Тогда можно не отводить пипетку от клетки,а подать в нее отрицательное давление и разрушить изолированный кусочек мембраны, перейдя таким образом в whole-cell mode:

5,59 КБ

Теперь пипетка соединена с внутриклеточной средой; поскольку клетка обычно маленькая, то, благодаря диффузии, состав цитоплазмы вскоре оказывается идентичным составу пипеточного раствора, поэтому мы, как и в предыдущем случае, знаем как состав жидкостей, так и разность потенциалов. Кстати, если в конфигурации inside-out пипеточный электрод был внеклеточным, а внутренний — внутриклеточным, то теперь их роли изменились, так что задавая потенциал, необходимо инвертировать полярность.
Преимущество этого метода состоит и в том, что здесь оказываются сохранны все клеточные структуры и регуляторные механизмы. Но есть и недостаток — мы измеряем суммарный ток всех каналов в клетке, а ведь мы только что радовались мощи метода, позволяющего наблюдать поведение единичной молекулы. Как же быть?
Оказывается, если после перехода в whole-cell mode медленно отводить пипетку от клетки, мембрана не отрывается сразу, а начинает вытягиваться в трубку — это видно на следующей фотографии:

38,26 КБ

Кстати, обратите внимание — в пипетке отчетливо видны кусочки цитоплазмы, попавшие туда после разрушения мембраны при переходе в whole-cell.

Следующая фаза процесса:

28,60 КБ

Мембранная трубка стала совсем тонкой и почти невидима ("протуберанец" у поверхности клетки — это небольшая часть цитоплазмы, оставшаяся в мембранной трубке).
В следующее мгновение трубка порвется, а мембрана сомкнется на пипетке в "вывернутом" виде — мы окажемся в конфигурации "outside-out":

5,02 КБ

В этом случае пипетка и ее электрод — подобно конфигурации whole-cell — внутриклеточные, мы свободно играем внеклеточным раствором, площадь исследуемой мембраны невелика, так что мы вновь можем изучать одиночные каналы.

Итак, patch-clamp — это метод, позволяющий изолировать фрагмент клеточной мембраны с имеющимися в нем ионными каналами, задавать определенную разность потенциалов через этот фрагмент, создавать по обе стороны мембраны среду с определенным составом и измерять, при этих хорошо контролируемых условиях, ток ионных каналов. Гигантская аналитическая мощь этого метода состоит в том, что он позволяет наблюдать поведение и химические превращения единичных молекул. Разные модификации метода позволяют в эксперименте менять различные — а в сумме все, представляющие интерес, переменные, способные влиять на поведение каналов.

В заключение — ссылки на другие посты, имеющие отношение к теме.

Фотография ооцитов Xenopus laevis в чашке Петри на столике для инъекций РНК

На последней фотографии — предметный столик моей patch-clamp установки . Видны две patch-пипетки (из них одна — на дне камеры, может быть даже на клетке; в плексигласовом зажиме с винтом — внешний электрод.

Об ионных каналах, транспортерах и их свойствах — в следующих выпусках. Если кому-нибудь интересно (о чем можно сообщить в комментах :) )

реимпорт
Оставить комментарий
(Удалённый комментарий)
[User Picture Icon]
From:hoegni
Date:Январь, 18, 2006 11:20 (UTC)
(Link)
Приятно :)
[User Picture Icon]
From:shao_s
Date:Январь, 18, 2006 10:49 (UTC)
(Link)
О! Спасибо. А то замахался объяснять, чем я по столько часов в день занимаюсь. Положу в мемориз, и буду всем ссылку давать.
Только одно уточнение.
Я в своё время (ещё в Австралии) долго мучался с inside-out-aми, и на собственном горьком опыте понял, что лучше не устраивать описанный flow displacement, а делать по классическому методу. А именно: из конфигурации cell-attached отводить пипетку плавно, формируя с двух сторон закрытую везикулу; затем поднимать пипетку в воздух и опускать во вторую ванночку, с внутриклеточным раствором. При переносе внешняя мембрана везикулы разрушается, и получаем тот же inside. Метод известный, потому рисовать не буду. Тут ведь что главное?
1. В описанном Вами методе патч получается именно "если повезёт" - процентах в 10 случаев. В описанном мной - процентах в 50-ти.
2. Более важно: в описанном Вами методе flow displacement, он же single chamber, поток жидкости, направленный на остриё пипетки, часто "сдувает" патч (тут получается ещё одно "если повезёт"); кроме того, крайне трудно добиться, чтобы в этом потоке не было турбуленций, в результате которых на пипетку периодически попадает внеклеточный раствор. А при попадании его - понятно, что кусок записи можно выкидывать.

Но всё равно - спасибо за внятный текст, который мне так давно и так лениво было писать :о)

Может, заодно уж напишете о perforated patch, nuclear patch, а также разнице между voltage-clamp и current-clamp?

Заранее спасибо :о)
[User Picture Icon]
From:hoegni
Date:Январь, 18, 2006 11:28 (UTC)
(Link)
За уточнения спасибо. Принято. Относительно пожеланий - про nuclear patch я даже не слышал, perforated patch не пробовал. Вообще-то я работал с whole-cell и очень немного - в out-out. Но тем не менее да, написать о разнице между current clamp и voltage clamp, а так же о perforated patch можно.
[User Picture Icon]
From:ruslanka
Date:Январь, 18, 2006 11:00 (UTC)
(Link)
Сказочно. Может это в Wikipedia поместить?
[User Picture Icon]
From:shao_s
Date:Январь, 18, 2006 11:02 (UTC)
(Link)
Кстати, да. Это вариант. Только тогда уж "расширить и углУбить" стоит. Может, Вы займётесь переводом на украинский, а я - допишу немного дополнительно?
[User Picture Icon]
From:shao_s
Date:Январь, 18, 2006 11:01 (UTC)
(Link)
Да, ещё. Возможно, наряду с упоминанием Нехера и Сакмана стоило бы заметить, что сам по себе стеклянный электрод для клеточных отведений (и способ его изготовления) изобрёл Платон Костюк - в настоящее время академик НАН Украины, директор института Физиологии им. Богомольца в Киеве. Но это так, optional. Такие вещи людям "невовлечённым", разумеется, мало интересны.
[User Picture Icon]
From:zorgeo
Date:Январь, 18, 2006 11:02 (UTC)
(Link)
кусочек мембраны площадью 2*3.14*3 мкм2

площадь круга ПR^2 вообще-то
[User Picture Icon]
From:hoegni
Date:Январь, 18, 2006 11:19 (UTC)
(Link)
Нда... Тяжелый случай... Ща исправлю.
[User Picture Icon]
From:ruspect_nmr
Date:Январь, 18, 2006 12:19 (UTC)
(Link)
Очень надеюсь, что Вы не против ссылки на этот Ваш пост здесь: http://www.livejournal.com/community/dilettante_ru/14537.html?mode=reply
[User Picture Icon]
From:hoegni
Date:Январь, 18, 2006 14:23 (UTC)
(Link)
Напротив, мне приятно.
[User Picture Icon]
From:vvz
Date:Январь, 18, 2006 18:14 (UTC)
(Link)
Хорошее описание и иллюстрации замечательные! Спасибо!
Я на написание подобного текста так и не сподобился (да и фотографий таких мне бы не сделать - разве что осциллятор фотографировать, но он малоинтересен :-)).
[User Picture Icon]
From:hoegni
Date:Январь, 18, 2006 22:46 (UTC)
(Link)
Да, фотографии оказались весьма полезны :)
А может теперь и Вас вдохновит? :)
[User Picture Icon]
From:chertov
Date:Январь, 18, 2006 18:50 (UTC)
(Link)
И интересно, и хорошо написано. Я знал только общие принципы (вводная часть). А как всё меряется, не представлял.
[User Picture Icon]
From:hoegni
Date:Январь, 18, 2006 22:46 (UTC)
(Link)
Рад, что Вам понравилось. Я Ваши тексты всегда с удовольствием читаю.
[User Picture Icon]
From:shao_s
Date:Январь, 19, 2006 10:46 (UTC)
(Link)
Итак, обещанное дополнение насчёт нуклеар патч:
----------
В cлучае, когда количество исследуемых рецепторов на поверхности мембраны нейрона мало, либо, при экспресси рецепторов не в нервных клетках, такая экспрессия протекает малорезультативно, прибегают к модификации метода, называемой "nuclear patch". Основной целью данного метода является повышение вероятности попадания единичного рецептора на пипетку путём увеличения площади отрываемого от клетки участка мембраны; сам же метод состоит в следующем.
Отводящая пипетка подводится к клетке, а затем рывком пробивает мембрану. После чего кончик пипетки подводится к клеточному ядру, и, путём подачи на пипетку небольшого отрицательного давления, к ядру присасывается. Затем пипетка с ядром на конце плавно отводится назад и вынимается из клетки. Выведение пипетки из клетки необходимо произвести таким образом, чтобы участок мембраны в месте выхода "наделся" на присосавшееся ядро и оторвался, обернувшись вокруг него.
В результате получается специфический вариант outside-out patch, при котором гораздо больший, чем в обычном варианте метода, участок мембраны присоединён к концу пипетки, будучи обёрнутым вокруг клеточного ядра. Таким образом, вероятность нахождения нужного единичного рецептора на оторванном участке мембраны заметно повышается.

Картинка вот: http://www.ljplus.ru/img/s/h/shao_s/NP.jpg
Подписывал картинку по-украински, но так, чтобы надписи легко было заменить на русские. Если не получится - пишите, сделаю и русский вариант.

Теперь по части инсайд-аута.
Думаю, в Ваш текст, когда будете компилировать, перед абзацем о нём надо написать что-то вроде "Inside-out patch, в зависимости от конкретных условий эксперимента, может быть получен несколькими способами." После чего Ваш текст, а затем "...однако более надёжным, хотя и более сложным, является иной метод" - и мой текст отсюда: http://hoegni.livejournal.com/31420.html?thread=185532#t185532
Картинка к нему - вот: http://www.ljplus.ru/img/s/h/shao_s/IOP.jpg
Также, думаю, неплохо было бы дать в тексте пару иллюстраций типичных электрических ответов от целой клетки и единичных речепторов. Для voltage-clamp у меня такое есть, и я их сегодня-завтра сделаю. А нет ли у Вас для current-clamp?
Ну, и последнее. Стоит ли нам обсуждать/компилировать текст статьи для Википедии здесь, или перейдём на общение письмами?
[User Picture Icon]
From:hoegni
Date:Январь, 19, 2006 11:41 (UTC)
(Link)
Да, метод весьма остроумен.

По поводу inside-out. Пожалуй, я воздержусь от оценочных высказываний, но оба метода опишу.

Хороший электрический ответ на амилорид на whole-cell у меня даже есть - вот здесь:
http://www.ljplus.ru/img/h/o/hoegni/2006_01_12R1.gif
http://www.ljplus.ru/img/h/o/hoegni/2006_01_12R2.gif

Правда, вольт-амперные характеристики там не без странностей, но их я могу взять из другого эксперимента c тем же каналом. :)

На предмет current-clamp покопаюсь в архивах. Что-то приемлемое должно быть.

А вот одиночные каналы - с Вас. И, пожалуй, упоминание о Костюке. Своих героев следует знать, а Сакманн и Нехер вовсю пользовались его работами.

Кстати, нам надо будет продумать вопросы языка, а то у Вас на иллюстрации украинский язык путем поднятия пипетки из раствора мгновенно превращается в английский :)

Думаю, что по поводу Википедии можно и правда перейти к письмам. Мой адрес можно взять из userinfo.

Вот одиночные

[User Picture Icon]
From:st_baa
Date:Ноябрь, 16, 2012 14:39 (UTC)
(Link)
Возможно, глупый вопрос, но...
Размер канала в клетке, как я понимаю, порядка нескольких нанометров. Размер кончика пипетки - несколько микрон. Каким образом, тогда можно "захватить" один канал в режиме cell-attached?
[User Picture Icon]
From:hoegni
Date:Ноябрь, 19, 2012 13:56 (UTC)
(Link)
Вот если бы канал был внесколько микрон, а пипетка - в несколько нанометров, то было бы сложнее :)

Вообще-то пипетки для записи одиночных каналов стремятся делать поменьше - диаметр около 0.8-1 мкм. Разумеется, канал все равно на несколько порядков меньше. Но мембрана ведь не забита каналами под завязку, так что, если повезет, то в этой области площадью в пару мкм^2 окажется всего один канал.
(Оставить комментарий)
Top of Page Разработано LiveJournal.com