?

Log in

No account? Create an account
 

Patch-Clamp (Метод локальной фиксации потенциала) - Отклики

About Patch-Clamp (Метод локальной фиксации потенциала)

Previous Entry Patch-Clamp (Метод локальной фиксации потенциала) 22 фев, 2006 @ 05:17 Next Entry
Данная запись доступна соавтору и переводчику статьи для Wikipedia и предназначена для обсуждения этой статьи.
Patch-clamp (англ. patch – заплатка, clamp – здесь: захват, фиксация) — один из методов электрофизиологии, позволяющий изолировать фрагмент клеточной мембраны с имеющимися в нем ионными каналами, задавать определенную разность потенциалов через этот фрагмент, создавать по обе стороны мембраны среду с определенным составом и измерять, при этих хорошо контролируемых условиях, ток ионных каналов. Гигантская аналитическая мощь этого метода состоит в том, что он позволяет наблюдать поведение и химические превращения единичных молекул. Разные модификации метода позволяют в эксперименте менять различные — а в сумме все, представляющие интерес, переменные, способные влиять на поведение каналов.

Задача: исследование трансмембранных ионных токов.

Живые клетки покрыты мембраной, структурную основу которой составляет двойной слой липидов, слабо проницаемый для воды и практически непроницаемый для ионов небольшого радиуса. Однако, клетка должна обмениваться этими веществами с внешней средой. Кроме того, трансмембранные ионные потоки важны для процессов возбуждения клетки и передачи сигналов. Эти потоки осуществляются через встроенные в мембрану белки — каналы и транспортеры.

Транспортеры — это белки, которые образуют с переносимым веществом комплекс по одну сторону мембраны, после чего меняют конформацию, так что транспортируемое вещество оказывается по другую сторону мембраны, и там его освобождают. По пути заметим, что самый важный транспортер в клетках эукариот – это натрий-калиевый насос, который активно, используя энергию АТФ, переносит за каждый цикл своей работы 3 иона Na+ из клетки и 2 иона K+ в клетку. Одна молекула этого транспортера выполняет примерно 103 циклов в секунду.

Каналы — это белки, которые формируют поры в мембране. Однако радиус и распределение заряженных функциональных групп в этих порах таково, что они селективны — проницаемы только для определенных ионов. В частности, имеются натриевые и калиевые, а так же хлоридные каналы. В действительности, для каждого из этих ионов имеется довольно много различных каналов. Через одиночный канал за секунду проходит в типичном случае 106 — 107 ионов.

Далее, если имеется канал и через него идет поток ионов, то вместе с ними переносится и заряд — то есть течет электрический ток, который можно измерить. (Проводимость одиночного канала в открытом состоянии колеблется, в зависимости от типа канала, от 1–2 до 30–50 пикосименсов, так что при разности потенциалов в 100 мВ имеем ток в несколько пикоампер.

Решение. Patch-clamp, его варианты и конфигурации.
В 1981 г. немецкие исследователи E.Neher и B.Sakmann обнаружили, что если стеклянной пипеткой с диаметром 1–2 микрона коснуться клеточной мембраны, то между ними образуется контакт с сопротивлением в несколько гигаОм, при чем контакт этот оказывается механически довольно прочным. В дальнейшем такой контакт мы будем называть gigaseal (Принятое в учебниках русское название — высокоомный контакт).  Если такую пипетку заполнить раствором электролита и поместить в нее хлор-серебряный электрод, другой электрод поместить в омывающий клетку раствор, а между ними поставить оборудование, которое будет задавать определенную разность потенциалов между электродами и измерять ток, который для этого необходим, то мы и получим patch-clamp установку. Данная разработка стала возможной благодаря использованию стеклянных микроэлектродов, изобретённых и внедрённых П.Г. Костюком (в настоящее время - академик НАН Украины, директор Института Физиологии НАНУ им. Богомольца).

На фото 1 показана часть такой установки.

36,74 КБ

Огромная сфера, часть которой видна на мониторе в центре фотографии – это клетка (ооцит лягушки Xenopus laevis), находящийся в данный момент на предметном столике микроскопа, к нему подведена patch-пипетка, ее диаметр у носика – около 3 микрон. После установления gigaseal она изолирует фрагмент мембраны диаметром 3 мкм2, и если в этом фрагменте окажутся ионные каналы, их ток можно будет записывать.


Только что описанная конфигурация  называется cell-attached patch-clamp. Она иллюстрируется следующей схемой:

2,41 КБ

Эта конфигурация, однако, имеет два неудобства.
Во-первых, она не позволяет с достаточной надежностью измерять (а тем более — задавать!) трансмембранную разность потенциалов — поскольку оба электрода — как пипеточный, так и внешний, находятся по одну сторону мембраны. Вообще-то можно, использовав омывающий раствор с ионной композицией, повторяющей состав цитоплазмы, деполяризовать мембрану вне пипетки, так что разность потенциалов между внешним электродом и цитоплазмой исчезнет, а тогда разность потенциалов между электродами окажется равна трансмембранному потенциалу — но это весьма приблизительно, так как точный состав цитоплазмы нам вообще-то неизвестен.
Во-вторых,эта конфигурация не позволяет менять состав среды вне пипетки (как цитоплазма была, так и есть).
В силу этих причин cell-attached mode применяется довольно ограниченно.

Однако, если пипетку быстрым движением отвести от клетки, то, если повезет, "внутренний" кусочек мембраны оторвется от клетки и получится конфигурация inside-out (потому, что внутренняя, обычно обращенная к цитоплазме, сторона мембраны, окажется снаружи – в омывающем растворе, а наружная – внутри пипетки. (Картинка на схеме 2.) Альтернативный метод перехода в inside-out конфигурацию заключается в следующем:из конфигурации cell-attached пипетку отводят плавно, формируя с двух сторон закрытую везикулу; затем поднимают пипетку в воздух и опускают во вторую ванночку, с внутриклеточным раствором. При переносе внешняя мембрана везикулы разрушается, в результате формируется конфигурация inside-out.

2,41 КБ

Теперь разность потенциалов на фрагменте мембраны строго равна разности потенциалов между электродами. Очевидно, что при использовании такой модификации пипетку заполняют раствором, имитирующим внеклеточную среду, тогда как омывающий раствор делают близким по составу к цитоплазме. При этом, меняя состав омывающего раствора, можно изучать, как такие изменения в цитоплазме (ведь омывающий раствор контактирует с цитоплазматической стороной мембраны) будут действовать на поведение канала. При этом мы точно знаем как состав жидкости по обе стороны мембраны, так и разности потенциалов, что позволяет достаточно точно характеризовать каналы, используя уравнения Нернста и Гольдмана-Ходжкина-Каца, так что на этом уровне электрофизиология превращается в физику каналов. при этом, если в изолированный участок мембраны попал один канал, то мы наблюдаем поведение единичной молекулы и, если это лиганд-регулируемый канал-рецептор, то ее взаимодействие с другими единичными молекулами.

Ну а если мы хотим менять состав внеклеточной среды? Тогда можно не отводить пипетку от клетки,а подать в нее отрицательное давление и разрушить изолированный кусочек мембраны, перейдя таким образом в whole-cell mode:

5,59 КБ

Теперь пипетка соединена с внутриклеточной средой; поскольку клетка обычно маленькая, то, благодаря диффузии, состав цитоплазмы вскоре оказывается идентичным составу пипеточного раствора, поэтому мы, как и в предыдущем случае, знаем как состав жидкостей, так и разность потенциалов. Кстати, если в конфигурации inside-out пипеточный электрод был внеклеточным, а внутренний — внутриклеточным, то теперь их роли изменились, так что задавая потенциал, необходимо инвертировать полярность.
Преимущество этого метода состоит и в том, что здесь оказываются сохранны все клеточные структуры и регуляторные механизмы. Но есть и недостаток — мы измеряем суммарный ток всех каналов в клетке, а ведь мы только что радовались мощи метода, позволяющего наблюдать поведение единичной молекулы. Как же быть?
Оказывается, если после перехода в whole-cell mode медленно отводить пипетку от клетки, мембрана не отрывается сразу, а начинает вытягиваться в трубку — это видно на следующей фотографии:

38,26 КБ

Кстати, обратите внимание — в пипетке отчетливо видны кусочки цитоплазмы, попавшие туда после разрушения мембраны при переходе в whole-cell.

следующая фаза процесса:

28,60 КБ

Мембранная трубка стала совсем тонкой и почти невидима ("протуберанец" у поверхности клетки — это небольшая часть цитоплазмы, оставшаяся в мембранной трубке).
В следующее мгновение трубка порвется, а мембрана сомкнется на пипетке в "вывернутом" виде — мы окажемся в конфигурации "outside-out":

5,02 КБ

Итак, пипетка и ее электрод — подобно конфигурации whole-cell — внутриклеточные, мы свободно меняем состав внеклеточного раствора, площадь исследуемой мембраны невелика, так что мы вновь можем изучать одиночные каналы.

Интересная разновидность patch-clampnuclear patch. (Фиксация потенциала с клеточным ядром).

33,84 КБ

Этот метод применяется в случае, когда количество исследуемых каналов на поверхности мембраны мало. Основной целью данного метода является повышение вероятности попадания единичного рецептора на пипетку путём увеличения площади отрываемого от клетки участка мембраны; сам же метод состоит в следующем. Пипетка подводится к клетке, а затем рывком пробивает мембрану. После чего кончик пипетки подводится к клеточному ядру, и, путём подачи на пипетку небольшого отрицательного давления, к ядру присасывается. Затем пипетка с ядром на конце плавно отводится назад и вынимается из клетки. Выведение пипетки из клетки необходимо произвести таким образом, чтобы участок мембраны в месте выхода "наделся" на присосавшееся ядро и оторвался, обернувшись вокруг него.
В результате получается специфический вариант outside-out patch, при котором гораздо больший, чем в обычном варианте метода, участок мембраны присоединён к концу пипетки, будучи обёрнутым вокруг клеточного ядра. Таким образом, вероятность нахождения нужного единичного рецептора на оторванном участке мембраны заметно повышается.

Voltage clamp и Current clamp (Фиксация потенциала и фиксация тока).
Когда изучаются изменения проводимости однотипных каналов в ответ на какие-то химические воздействия или зависимость их проводимости от разности потенциалов на мембране, удобно фиксировать потенциал и измерять ток канала — как мы до сих пор и описывали. Этот, самый частый вариант patch-clamp, называется voltage clamp. Однако, иногда исследователя интересуют процессы трансмембранного переноса ионов, связанные с изменением мембранного потенциала — например, проведение нервного импульса. В таких случаях можно поступить противоположным образом: зафиксировать на постоянном уровне ток (например, можно предположить, что суммарный ток через все ионные каналы в каждый момент времени равен нулю, соответственно установить нулевой ток), и изучать изменения разности потенциалов при этом. Такой вариант называется current clamp.

Примеры записей, получаемых методом patch-clamp

36,20 КБ

Запись одиночного канала (рецептора глицина). Четко видны два состояния: закрытое (ему соответствует нулевой ток) и открытое (ему соответствует ток примерно в 7 пикоампер). Канал время от времени спонтанно переходит из одного состояния в другое, промежуточных состояний нет. Запись позволяет получить две важнейшие характеристики канала: проводимость (исходя из величин трансмембранного потенциала и тока) и вероятность нахождения в открытом состоянии (определяемое как отношение времени, когда канал открыт к времени, когда он закрыт). К слову, чаще всего активность канала физиологически регулируется путем изменения этой вероятности).
 64,11 КБ
Запись в конфигурации whole-cell. Клетка эпителия собирательной трубки. Трансмембранный потенциал -60 мВ. С интервалами в 1 минуту на 30 секунд в омывающий раствор вводится амилорид — ингибитор эпителиального натриевого канала. Кстати, чувствительность к ингибиторам — это еще одна из важнейших характеристик канала. Введение амилорида всякий раз приводит к падению тока до нуля, из чего следует, что практически вся проводимость при -60 мВ в данной клетке — это проводимость эпителиального натриевого канала. В противоположность предыдущей записи, изменения тока выглядят непрерывными — это связано с тем, что одновременно записывается много каналов (около 2000), соответственно, имеется примерно 2000 уровней тока — от "все открыты" до "все закрыты".
Оставить комментарий
[User Picture Icon]
From:ruslanka
Date:Февраль, 22, 2006 08:28 (UTC)
(Link)
уважаю
[User Picture Icon]
From:hoegni
Date:Февраль, 22, 2006 12:35 (UTC)
(Link)
Я рад. А как насчет замечаний и предложений? :)
[User Picture Icon]
From:shao_s
Date:Февраль, 22, 2006 12:57 (UTC)
(Link)
Закрытому состоянию соответствует верхний уровень. Ро уменьшается случайно - это следствие оффлайн-фильтрации.

Да, и ещё: это канал глицинового рецептора, а не ацетилхолинового.

В остальном - весьма хорошо, как по мне. Спасибо.
[User Picture Icon]
From:hoegni
Date:Февраль, 23, 2006 18:51 (UTC)
(Link)
Исправил
[User Picture Icon]
From:shao_s
Date:Февраль, 22, 2006 19:20 (UTC)
(Link)
Кстати, я вот думаю: может, в качестве примера установки для пэтча мои фотки вот отсюда
http://shao-s.livejournal.com/64675.html
привести? Благо, там уже к ним цифирки и пояснения есть?
[User Picture Icon]
From:hoegni
Date:Февраль, 23, 2006 17:48 (UTC)
(Link)
Вообще-то мне кажется, что графического материала уже хватает. И даже если помещать фотографию установки, то, в интересах единства места, лучше той, фрагменты которой уже есть.

Сегодня-завтра добавлю подписи "открыто - закрыто" к записи глицинового рецептора и на этом предлагаю считать запись готовой к публикации.

Как она технически выполняется?
[User Picture Icon]
From:shao_s
Date:Февраль, 25, 2006 00:39 (UTC)
(Link)
Ну что, я рисунки перебил, текст Русланы подкорректировал. Будем выкладывать?
[User Picture Icon]
From:shao_s
Date:Февраль, 25, 2006 00:44 (UTC)
(Link)
Cудя по тому, что ты мне прислал в почту - ты предпочитаешь. дабы в русскую Вику этот текст выложил я? Я верно понял?
[User Picture Icon]
From:hoegni
Date:Февраль, 25, 2006 20:18 (UTC)
(Link)
Думаю, что да. А я зайду посмотреть, что получилось, и, может быть, еще поработаю над текстом. Заранее спасибо. :)
[User Picture Icon]
From:shao_s
Date:Февраль, 25, 2006 03:24 (UTC)

Состояние вопроса

(Link)
В общем, дело такое. Просидел я часа 4, сверстал и выложил украинский текст. Потом подумал-подумал. и дописал в него ещё один раздел - Perforated patch. Что в итоге вышло. ты можешь поглядеть здесь: http://uk.wikipedia.org/wiki/Patch-clamp.

Руслану я попросил перевести этот раздел для тебя - а то уже совсем утро скоро, никаких сил нет. Если она за выходные тебе не пришлёт перевод. я сделаю.

И вопрос: в русскую Вику ты будешь текст верстать и постить. или это сделать мне? А то я так и не понял по твоим письмам.
[User Picture Icon]
From:shao_s
Date:Февраль, 26, 2006 19:23 (UTC)

Re: Состояние вопроса

(Link)
Как говорил известный персонаж - продолжаем разговор. Я выложил текст в твоей вёрстке с минимальными правками; также переложил твои изображения на сайт русской Вики. Что в итоге получилось - смотри здесь:

http://ru.wikipedia.org/wiki/Patch-clamp

Тут проблемы следующие.

1. Мне уже настучали по голове тамошние модераторы, что, мол, рисунки противоправные (см. здесь: http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9E%D0%B1%D1%81%D1%83%D0%B6%D0%B4%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D0%B5_%D1%83%D1%87%D0%B0%D1%81%D1%82%D0%BD%D0%B8%D0%BA%D0%B0:Shao)
Я поставил GDFL - лицензию на два из них: схему nuclear patch и страссу с единичным глициновым рецептором. Остальные там твои. Потому, пожалуйста. озаботься каким-нибудь их лицензионным оформлением, ладно? А то грозят через неделю поудалять.

2. Сама по себе вёрстка. Мне дизайн как таковой и разбиение на главы в итоге не так чтоб жутко нравятся - но тут ты хозяин, потому я выправлять не стал. Если что - меняй ты.

3. Текст раздела perforated patch, если Руслана всё ещё не выслала - к исходу понедельника тебе подгоню.
[User Picture Icon]
From:shao_s
Date:Февраль, 26, 2006 20:27 (UTC)

Держи перевод Perforated patch:

(Link)
Perforated patch - это специфический вариант patch-clamp в whole-cell mode. В данном случае после формирования гигаомного контакта в пипетку подаётся новый раствор. содержащий небольшое количество специального антибиотика, например Амфоторецина-В либо Грамицидина. Антибиотики этого класса образуют отверстия в клеточной мембране на участке, которая присоединена к электроду. Такой подход позволяет избежать замещения внутренней среды клетки раствором из пипетки-электрода, тоесть клетка остаётся живой и пребывает в максимально возможно неповреждённом виде. Таким образом, ответы клетки на раздражение являются максимально приближёнными к естественным. В то же время, данному методу присущ ряд едостатков.
Во-первых, по сравнению с классическим whole-cell mode, электрическое сопротивление доступа (которое состоит из сопротивления пипетки и сопротивления в месте соединения пипетки с мембраной) является значительно более высоким. Это понижает уровень распознавания електрического тока, повышает уровень шума при записи, и экспоненциально увеличивает значения всех ошибок, связанных с фюктуациями сопротивления полной цепи (от электрода во внешнем растворе до электрода в пипетке). Во-вторых, для того, чтобы антибиотик подействовал, требуется доврльно много времени (до 30 минут), что существенно уменьшает полезный период эксперимента. И в-третьих, антибиотик повреждает мембрану также и в месте соединения с кончиком пипетки, что приводит к ускоренному разрушению гигаомного контакта и также уменьшает эффективное экспериментальное время. Таким образом, данный вариант метода может быть эффективно использован только в экспериментах, которые не требуют продолжительного времени для выявления исследуемых эффектов.
[User Picture Icon]
From:shao_s
Date:Февраль, 27, 2006 20:30 (UTC)
(Link)
Кстати говоря, насколько я помню, это первый действительный пример того, о чём много и разнообразно стонали в русской и украинской Вике - совместное написание статьи на близких языках. И сама статья получилась неплохая, на общем фоне.

Может, в связи с этим предложим её синхронно выложить в обоих разделах как "Статью недели"?
[User Picture Icon]
From:hoegni
Date:Февраль, 28, 2006 11:23 (UTC)
(Link)
Давай предложим. И как это делается?
[User Picture Icon]
From:shao_s
Date:Март, 3, 2006 16:34 (UTC)
(Link)
На меня снова из русской версии наехали -
http://uk.wikipedia.org/wiki/%D0%9E%D0%B1%D0%B3%D0%BE%D0%B2%D0%BE%D1%80%D0%B5%D0%BD%D0%BD%D1%8F_%D0%BA%D0%BE%D1%80%D0%B8%D1%81%D1%82%D1%83%D0%B2%D0%B0%D1%87%D0%B0:Shao#.D0.A1.D1.82.D0.B0.D1.82.D1.8C.D1.8F_Patch-clamp_.D0.B2_.D1.80.D1.83.D1.81.D1.81.D0.BA.D0.BE.D1.8F.D0.B7.D1.8B.D1.87.D0.BD.D0.BE.D0.B9_.D0.92.D0.B8.D0.BA.D0.B8.D0.BF.D0.B5.D0.B4.D0.B8.D0.B8

Пожалуйста, разберись, чего им надо. В "обсуждении" данной статьи в русской Вике - первоначальный текст претензий.
[User Picture Icon]
From:hoegni
Date:Март, 3, 2006 18:32 (UTC)
(Link)
Вопрос "Чего надо?" я там задал.

И одна поправка: запись в whole-cell сделана в режиме voltage clamp.
(Оставить комментарий)
Top of Page Разработано LiveJournal.com